Удивительный бактериальный фермент для биотехнологии

Сотрудники лаборатории дизайна и синтеза биологически активных соединений Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН работают над созданием новых эффективных методов получения нуклеозидов -- важной группы природных соединений. Нуклеозиды - это молекулы, состоящие из остатков азотистого основания и сахара (рибозы или дезоксирибозы). В настоящее время в клинической практике используется ряд современных препаратов, созданных на основе модифицированных нуклеозидов, которые обладают широким спектром биологической активности: противоопухолевой (кладрибин, флударабин, пентостатин, неларабин, видаза, децитабин и др.), противовирусной (гепатит С, герпес, ВИЧ и др.- рибавирин, видарабин, зидовудин, ламивудин и др). 

Для получения практически важных нуклеозидов активно разрабатываются технологии, основанные на ферментативных реакциях трансгликозилирования - переноса углеводного остатка с одного гетероциклического основания на другое. Эти реакции катализируют ферменты -- нуклеозидфосфорилазы, которые осуществляют обратимый фосфоролиз рибонуклеозидови 2′-дезоксирибонуклеозидов с образованием соответствующего гетероциклического основания и (2'-дезокси)рибозо-1-фосфата. Расширение возможностей использования ферментов для получения нуклеозидов, нуклеиновых оснований и их производных является актуальной задачей ученых.

Одно из направлений в этой деятельности - получение цитокининов, которые являются важной группой растительных гормонов и играют решающую роль в многочисленных биохимических процессах, происходящих в растениях: стимулируют клеточное деление, увеличение объема клеток, дифференцировку побегов, влияют на биосинтез пигментов, а также имеют ряд других функций. Препараты, содержащие цитокинины, пользуются большим спросом в растениеводстве. Цитокининовую пасту применяют как для комнатных цветов и растений, так и для садовых и огородных культур. Список растений очень большой. Туда входят орхидеи, фиалки, адениумы, химеры, драцены, розы, фикусы, гибискусы, глоксинии, пеларгонии, антуриумы, цитрусовые, суккуленты и многие другие растения.

К настоящему времени разработаны достаточно эффективные схемы химического синтеза цитокининов. Однако разнообразие получаемых с помощью химического синтеза соединений ограничено их устойчивостью. Ферментативный гидролиз лишен этих ограничений – он протекает в более мягких условиях.

Природные цитокинины являются производными аденина, которые имеют на аминогруппе в 6-ом положении аденина очень объемный заместитель -- изопренильный или фенильный остаток (Рис.1). Поэтому выбор фермента для их получения является нетривиальной задачей.

Используя свой опыт и литературные данные ученые из ИМБ остановили выбор на хорошо изученном и доступном бактериальном ферменте – пуриннуклеозидфосфорилазе (ПНФ) E. coli. Этот необычный фермент кишечной палочки может катализировать фосфоролиз широкого спектра 2- и 6-замещенных производных пуринов, причем фосфоролиз N6-замещенных аденозина происходит также эффективно, как и аденозина. Он участвует в биосинтезе нуклеозидов в бактериях.

Источник: depositphotos

Однако, равновесие реакции фосфоролиза, катализируемой этим ферментом, резко смещено в сторону образования нуклеозидов. Поэтому, чтобы получать цитокинины из нуклеозидов, необходимо было существенно увеличить выходы нуклеиновых оснований. Для этого был предложен простой и изящный способ – замена фосфата на соли мышьяковистой кислоты Na2HAsO4. В её присутствии гидролиз N-гликозидной связи в нуклеозиде становится необратимым. Образующийся рибозо-1-арсенат легко и быстро гидролизуется. Реакция протекает в водном растворе при pH 7.5 при 50оС, а конечные продукты легко кристаллизуются с высокими выходами (81-93%) из реакционной смеси после охлаждения (Vladimir E. Oslovsky, Pavel N. Solyev, Konstantin M. Polyakov, Cyril S. Alexeev and Sergey N. Mikhailov «Chemoenzygmatic synthesis of cytokinins from nucleosides: ribode as blocking group» Org. Biomol. Chem., 2018, 16, 2156 -2163).

Итак, эффективный метод ферментативного получения цитокининов был успешно разработан благодаря использованию бактериальной ПНФ с очень широкой субстратной специфичностью, и замены фосфата на соли мышьяковистой кислоты. Применение нового эффективного метода позволило существенно расширить доступный спектр структур, играющих роль регуляторов роста и развития растений. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 16-14-00178.

Источник: