Управление полом

Источник: Журнал "НАУКА И ЖИЗНЬ"

Редактирующий молекулярный комплекс CRISPR состоит из фермента Cas9 и небольшой направляющей РНК (gRNA), которая подводит фермент к гену, требующему редактирования. Ген Cas9 вводили в обе копии хромосомы 6 у самок, ген gRNA — в Y-хромосому самцам. В потомстве хромосома 6 с геном Cas9 попадала ко всем эмбрионам, но только у самцов фермент встречался с направляющей РНК и вносил мутации в гены, необходимые для развития эмбриона.

Английский король Генрих VIII очень хотел сына. Но с сыновьями ему не везло: из шести детей от его первой жены, Екатерины Арагонской, выжила только дочь Мария (впоследствии королева Англии). По разным политическим соображениям было крайне важно, чтобы в Англии появился законнорождённый принц-наследник. Тогда Генрих развёлся, попутно поссорившись с Папой Римским и проведя церковную реформу, и женился второй раз. Вторая жена, Анна Болейн, вместо долгожданного сына принесла дочь Елизавету, ещё одну будущую королеву. Потом Анна ещё дважды беременела сыновьями, но беременности заканчивались неудачно. Генрих был переменчивого и крутого нрава, так что стоит ли удивляться, что Анну в конце концов казнили. Сына король получил только от третьей жены. Возможно, Генрих VIII втайне сожалел о том, что нет способа заранее задать пол ребёнку, чтобы получить на выходе гарантированного мальчика.

Х-сперматозоиды и Y-сперматозоиды, отличающиеся интенсивностью окраски и заключённые в отдельных каплях жидкости, проходят по очереди через луч лазера. Отражённый и рассеянный свет от каждой клетки приходит к детектору, который определяет, как зарядить каплю с клеткой, которая только что прошла через лазер. Капли с клетками заряжает специальное устройство, после чего капли проходят через электромагнитное поле и отклоняются влево или вправо в соответствии со своим зарядом.

Современные родители избавлены от подобных династических хлопот. Но всё же и они порой огорчаются из-за того, что вместо страстно желаемого мальчика появляется девочка или наоборот. Некоторые даже начинают искать помощи у экстрасенсов и знахарей либо прибегают к странным ритуалам, вычитанным в жёлтой прессе, — всё для того, чтобы «запрограммировать» пол будущего ребёнка. Советы эти и ритуалы выглядят довольно дико. Но если посмотреть беспристрастно с биологической точки зрения — есть ли способы повлиять на пол ребёнка?

У нас, как и у большинства млекопитающих, пол определяется половыми хромосомами Х и Y. В момент оплодотворения с яйцеклеткой, которая всегда несёт одну Х-хромосому, сливается сперматозоид, в котором может быть или Х-хромосома, или Y. Если у сперматозоида была хромосома Х, то у эмбриона окажутся две Х-хромосомы, это значит — девочка. Если у сперматозоида был Y, то получится XY — мальчик. Y-хромосома несёт в себе гены, от которых зависит «мужское» развитие; в отсутствие «игрека» получается женский пол. Конечно, можно представить, как мы уже после оплодотворения манипулируем хромосомами или перенастраиваем гены у зародыша, чтобы получить тот пол, который нужно. Но это сложно и хлопотно; кроме того, так мы будем вмешиваться в уже запущенную молекулярно-генетическую программу. Проще было бы получить нужный пол, отбирая оплодотворённые яйцеклетки с ХХ- или ХY-хромосомами или же помогая Х- или Y-сперматозоидам выиграть гонку во время оплодотворения.

Считается, что у Х- и Y-сперматозоидов равные шансы достичь яйцеклетки, так что здесь всё решает случай. Тем не менее многим животным как будто удаётся повлиять на статистическое соотношение полов 50:50, обусловленное комбинацией половых хромосом. Для начала стоит упомянуть, что есть на свете ящерицы, у которых пол потомства зависит не только от хромосомного набора, но и от температуры, при которой развиваются эмбрионы. Так происходит, например, у бородатых агам Pogona vitticeps*. Половые хромосомы у агам (а также у некоторых других рептилий, у птиц и некоторых насекомых) называются Z и W, и пол они определяют иначе, чем «наши» X и Y: у самок хромосомы разные — Z и W, а у самцов одинаковые — Z и Z. Если яйца агам созревают при температуре ниже 32оС, детёныши вылупляются в соответствии с хромосомным раскладом. Если же температура становится выше 32°С, то генетические самки так и остаются самками, но при этом и ZZ-эмбрионы превращаются в самок. То есть генетически они самцы, а физиологически и анатомически — самки. Всё дело в том, что гены, определяющие у агам пол, по-разному проявляют себя в зависимости от внешних условий.

Но это рептилии, а что у млекопитающих? Есть целый ряд исследований, которые говорят о том, что состояние самки влияет на пол потомства. Во-первых, определённую роль играет тестостерон, который синтезируется и в женском организме. Эксперименты с животными показали, что если у самки повышен уровень тестостерона в яичниках, то она будет рожать больше самцов. Предположительно, как об этом пишут исследователи из Оклендского университета (Новая Зеландия) в статье 2008 года в журнале «Biology of Reproduction», во время созревания яйцеклеток гормон действует на них так, что при оплодотворении они отдают предпочтение преимущественно Y-сперматозоидам. Во-вторых, есть данные, что на соотношение полов в потомстве влияет диета самки. Например, в статье 2007 года в «Biology of Reproduction» исследователи из Миссурийского университета (США) писали, что, если самок мышей кормить жирной пищей с повышенным содержанием насыщенных жиров, доля самцов в потомстве повысится с 48% до 60%. (Если жирной едой кормить самцов-отцов, на пропорцию полов это никак не влияет.) Также число самцов среди потомков увеличивается, если после зачатия у самки был повышен уровень глюкозы в матке. Предположительно, всё это создаёт благоприятные условия для развития именно мужских эмбрионов.

Казалось бы, вот и инструменты для управления полом — диета и гормональная терапия. Однако пока что и влияние тестостерона, и влияние диеты остаются на уровне гипотез, пусть и весьма серьёзных. В случае с тестостероном результаты экспериментов ещё не позволяют прояснить, что именно происходит на молекулярно-клеточном уровне. Одни исследователи говорят, что гормон влияет прямо на оболочки яйцеклетки, делая их более «дружелюбными» к сперматозоидам с Y-хромосомой. (При этом возникает следующий вопрос: на какой именно стадии развития яйцеклетки проявляется влияние тестостерона?) Другие же полагают, что тестостерон действует опосредованно, влияя на выживаемость мужских эмбрионов уже после зачатия. Эксперименты с питанием дают пока что противоречивые результаты: например, даже когда на жирной диете рождалось больше самцов, то оказывалось, что у самок при этом снижался тестостерон, что уже противоречило тестостероновой гипотезе.

Также надо учитывать, что возможные механизмы управления полом могут отличаться у животных, которые рожают сразу много детёнышей, и у животных, которые рожают одного детёныша. Соответственно экспериментальные результаты, полученные на мышах, следует с большой осторожностью распространять, например, на коров (и уж тем более на человека). Наконец, во всех подобных исследованиях речь идёт о вероятностях и процентах особей того или другого пола от общего числа потомков. То есть если и рассматривать гормональные и диетические механизмы как инструменты управления полом, то инструменты эти не очень надёжные — Генриха VIII они бы не устроили.

Возможно, в вопросе выбора пола лучше положиться на биотехнологии, которые могут дать более определённый результат. Так, минувшим летом в «EMBO Reports» была опубликована статья исследователей из Тель-Авивского университета, которые сумели полностью избавиться от самцов в потомстве у мышей. Для этого использовали метод генетического редактирования CRISPR, который сейчас чрезвычайно бурно развивается. Вкратце суть его такова: с помощью модифицированных бактериальных ферментов определённый участок ДНК разрезают, чтобы заставить клетку исправить повреждение. Но в клетку одновременно вводят шаблон, в соответствии с которым она должна исправить то, что повреждено, — так можно в прямом смысле отредактировать (или вообще отключить) нужный ген. Метод оказался довольно прост и точен по сравнению с другими методами генетического редактирования, так что сейчас с помощью CRISPR что только не редактируют — вплоть до эмбрионов человека.

Сам CRISPR — это ферменты и куски рибонуклеиновой кислоты (РНК), которые должны направить ферменты на нужный участок в геноме. Ферменты CRISPR и руководящие куски РНК можно закодировать в ДНК и вставить в геном клетки, тогда клетка сама будет производить CRISPR-аппарат. Но CRISPR — это довольно большая молекулярная машина. ДНК, в которой были закодированы разные элементы CRISPR, можно распределить между разными хромосомами. В экспериментах с мышами так и сделали: ДНК, кодирующую CRISPR-аппарат, внедрили в Y-хромосому у самцов и в одну из неполовых хромосом — хромосому 6 у самок. Фермент CRISPR должен был отключить гены, абсолютно необходимые для развития эмбриона. Каждому эмбриону доставалась неполовая шестая хромосома с половиной CRISPR-машины. Но у самок эта половина CRISPR ничего не могла сделать. А вот у самцов она встречала Y-хромосому с другой половиной CRISPR. Две половины редактирующей машины встречались и отключали те гены, против которых её и запрограммировали. В результате зародыши-самцы погибали, достигнув едва ли половины срока беременности. Впрочем, погибали не все самцы — некоторые выживали, так что метод ещё есть куда совершенствовать.

Для медицины такой трюк с «избиением» самцов в зародыше в обозримом будущем вряд ли пригодится — дело не столько в этике, сколько в сложностях генетического редактирования. Думается, что скорее этот метод найдёт применение в сельском хозяйстве. Например, в птицеводстве, на куриных фермах или в животноводческих хозяйствах, специализирующихся на молоке и молочных продуктах, где самцы в больших количествах просто не нужны. Хотя в том же животноводстве самцов порой больше ценят за то, что с них можно получить больше мяса, и в таком случае метод генетического редактирования можно просто перенастроить против самок.

Впрочем, в сельском хозяйстве уже сейчас применяют другой способ управления полом, просто отделяя X-сперматозоиды от Y-сперматозоидов. Такая сортировка клеток давно стала привычным методом в лабораториях, и используют его не только применительно к половым клеткам. Суть метода в следующем: допустим, у нас есть смесь клеток, и нам нужно посчитать и отделить одни клетки от других (например, живые от мёртвых, или лимфоциты одного типа от лимфоцитов другого типа, или сперматозоиды с Х-хромосомой от сперматозоидов с Y-хромосомой). Для этого мы сначала метим их так, чтобы один тип клеток отличался от другого; поскольку клетки часто отличаются поверхностными белками-рецепторами, то мы можем окрасить их с помощью красящей метки, которая будет связываться только с рецепторами одного типа клеток.

Затем клетки пропускают через проточное устройство, в котором они выстраиваются одна за другой: клетки проходят в узкий канал, вдоль стенок которого бежит жидкость. Получается, что через канал бегут две струи, одна в другой: внутренняя с клетками и внешняя, или струя-оболочка. За счёт особенностей гидродинамики одной и другой они не смешиваются, а клетки во внутренней струе начинают двигаться поодиночке; происходит то, что называется гидродинамическим фокусированием. На шеренгу клеток падает луч лазера, который отклоняется от каждой клетки и попадает в фотоприёмник. Поскольку клетки окрашены, их можно отличить друг от друга по отражённому свету и посчитать, сколько в образце клеток того или иного типа. (На самом деле в подобных устройствах оценивают довольно много оптических параметров, в совокупности позволяющих точно отличить клетки друг от друга.) Таков в общих чертах метод проточной цитометрии, когда клетки считают поштучно в токе жидкости.

Но нам нужно не посчитать, а рассортировать. И тогда в приборе появляются дополнительные ухищрения: идущие поодиночке клетки проходят через вибрирующий носик, который заключает каждую клетку в отдельную каплю жидкости. Если в капле находится клетка одного типа, каплю заряжают электрическим зарядом, после чего она проходит через магнитное поле, отклоняясь к одному из его полюсов, и попадает в ёмкость для клеток определённого типа. Если же в капле находится клетка другого типа, то каплю не заряжают, она никуда не отклоняется и попадает в другую ёмкость. (А можно снабжать капли с разными клетками разноимёнными зарядами.) Рассортированные клетки можно растить в культуре или ставить с ними какие-то эксперименты — при условии, что они хорошо перенесли всю процедуру.

Вернёмся к сперматозоидам. Нам нужно отделить те, что содержат Х-хромосому, от тех, что содержат Y-хромосому. X-хромосома по размеру больше, чем Y, поэтому если мы окрасим ДНК сперматозоидов, то Х-сперматозоиды окрасятся сильнее. Именно так их и разделяют — с помощью ДНК-красителя, который самой ДНК никак не вредит. В сельском хозяйстве, как мы уже говорили, такую сортировку давно используют, чтобы получать больше коров, которые могли бы давать молоко, вместо бесполезных бычков. Естественно, сортировку сперматозоидов пробуют использовать в медицине, например в экстракорпоральном оплодотворении — ЭКО. (Тут дело может быть не только в капризе родителей, но и в том, что есть очень тяжёлые наследственные болезни, связанные с тем или иным полом.) Эффективность метода достаточно высока: так, в статье 2014 года в журнале «Reproductive Biology and Endocrinology» говорится, что сортировкой сперматозоидов можно добиться 94-процентной вероятности девочек и 85-процентной вероятности мальчиков. Но эффективность тут относительная, и если речь идёт о какой-нибудь генетической болезни, ассоциированной с полом, то вероятность безопасного пола у ребёнка должна быть просто стопроцентная.

Возможно, такую стопроцентную вероятность даст альтернативный метод сортировки, описанный минувшим летом в статье в «PLOS Biology». Авторы статьи, сотрудники Университета Хиросимы, исходили из того, что между Х- и Y-сперматозоидами имеются очевидные генетические отличия, которые отражаются в белках, несущих на себе сперматозоиды. В частности, у мышиных сперматозоидов с Х-хромосомой на поверхности есть два толл-подобных рецептора (TLR), которых нет у сперматозоидов с «игреком».

Толл-подобные рецепторы играют ключевую роль во врождённом иммунитете: они распознают общие молекулярные структуры, характерные для различных патогенных микроорганизмов. У мышей в геноме закодировано 12 таких рецепторов, и два из них, TLR7 и TLR8, синтезируются именно у Х-сперматозоидов. Если к сперматозоидам добавляли противовирусное средство ресиквимод, которое активировало оба рецептора, то Х-сперматозоиды начинали двигаться в два раза медленнее Y-сперматозоидов. Причина была в том, что после активации иммунных рецепторов в клетке слабели энергетические реакции, из-за чего синтезировалось меньше аденозинтрифосфата (АТФ) — главной энергетической молекулы. То есть у сперматозоидов просто не хватало топлива, чтобы быстро двигаться.

После «забега» с противовирусным средством сперматозоиды разделялись на две части: кто-то был впереди, кто-то сзади. Когда теми и другими попробовали оплодотворить яйцеклетки, то среди эмбрионов, которые получались от быстрых сперматозоидов, 83% были самцами. А среди эмбрионов, которые получались от замедленных сперматозоидов, 81% были самками.

Надёжность, как видим, тоже не стопроцентная: среди замедленных Х-сперматозоидов могут оказаться сперматозоиды с «игреком», а среди быстрых Y-сперматозоидов попадаются «иксы», на которые замедление не подействовало. И вероятность рождения самца или самки тут даже меньше, чем в методе с окраской ДНК. Но метод с иммунными рецепторами проще и удобнее, и возможно, его удастся скорее довести до совершенства: например, найти какой-нибудь активатор рецепторов, который станет замедлять сперматозоиды ещё сильнее и который можно будет использовать не только при ЭКО, но и при обычном оплодотворении.

Подробнее см.: https://www.nkj.ru/archive/articles/37442/ (Наука и жизнь, Управление полом)